O presente estudo incluiu 42 pacientes com média de 59,45± 8,36 anos (variação de 47 a 78) diagnosticados histologicamente com carcinoma hipofaríngeo e 8 pacientes com pólipos de pregas vocais, com média de 55,68±8,27 anos (variação, 48–75), que serviram como controles pareados por idade e gênero. O estadiamento do tumor foi determinado de acordo com o American Joint Committee on Cancer (AJCC) e a classificação Tumor‐Node Metastasis (TNM). Nenhum paciente recebeu quimioterapia, radioterapia ou imunoterapia nos 2 meses anteriores à cirurgia. Foram excluídos pacientes com outras doenças crônicas, como tuberculose, diabetes, doenças autoimunes ou outros tumores malignos. Os tecidos cancerígenos e os pré‐cancerígenos foram identificados por estereoscopia e corte pós‐congelamento rápido. Dois pedaços de tecidos foram coletados e congelados rapidamente para extração de RNA e preparação de proteínas. Da mesma forma, controles normais que apresentaram febre ou infecção viral na última semana, gravidez ou acidente recente também foram excluídos do estudo. O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética do Institute of Basic Medicine da Shandong Academy of Medical Sciences e todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Amostras representativas de tumores e de tecidos de controle normais foram coletadas na cirurgia, congeladas imediatamente em tubos Eppendorf e armazenadas a ‐80°C para evitar a degradação de RNA e proteínas até o corte para análise por RT‐PCR e western blot.

O kit de extração de RNA total foi adquirido da Transgen Biotech Company (Pequim, China). A transcriptase reversa M‐MLV e a polimerase Taq DNA foram adquiridas da Promega Corporation (Madison, WI, EUA). Os primers de PCR para a detecção do mRNA da MMP‐2, MMP‐9 e β‐actina foram projetados com o Oligo Primer Analysis Software, versão 5.0 (NBA, Software and Research Services for Tomorrow's Discoveries, National Biosciences, Plymouth, MN, EUA). Os oligômeros de PCR foram sintetizados por um sintetizador de DNA/RNA (Applied Biosystems) na BioSune Biological Technology Corporation, Xangai, China. As sequências de primers estão listadas na tabela 1. O anticorpo monoclonal de coelho anti‐MMP‐2 e o anticorpo policlonal de coelho anti‐MMP‐9 foram adquiridos na Abcam Company (Cambridge, Inglaterra). O anticorpo policlonal de coelho antiactina foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EUA). O IgG de cabra anticoelho marcado com peroxidase de rábano silvestre foi comprado da Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. (Pequim, China).

O método RT‐PCR foi descrito brevemente. O RNA foi extraído dos tecidos com o método de guanidina tiocianato‐fenol‐clorofórmio. A qualidade do rendimento de RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1,5% em tampão Tris/Borato/EDTA a 0,5 moL. A densidade óptica das amostras de RNA foi medida e as amostras que mostraram uma razão A260/A280 de 1,8±2,0 foram usadas para obter o cDNA. A RT‐PCR foi feita com um kit de RNA PCR (Perkin Elmer, Norwalk, CT, EUA). A intensidade relativa (IR) de cada banda foi determinada de acordo com a seguinte equação: IR=a densidade da soma do gene alvo/a densidade da soma da β actina. Para excluir a possibilidade de contaminação, as reações que continham reagentes de RT‐PCR, inclusive primers de citocina‐PCR sem RNA da amostra, foram usadas como grupos de controle negativo.

A SDS PAGE e o ensaio de immunoblotting (western blot) foram feitos de acordo com as técnicas‐padrão. Resumidamente, os tecidos preparados (100mg) foram lisados a 4μ por 30min em tampão de lise (Beijing Leagene Biotech. Co, Ltd, Beijing, China). Os lisados foram centrifugados a 15.000rpm por 20min a 4μ para remover núcleos e tecidos não lisados. A concentração de proteína foi determinada com a solução para ensaio de proteína Bio Rad (Bio‐Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA) com albumina de soro bovino como padrão.13 As amostras de proteína foram fervidas por 10min e carregadas em um gel de SDS PAGE a 10%, seguido de eletroforese por 2h. As proteínas foram transferidas por eletroforese para uma membrana de nitrocelulose de 0,22μm. A membrana de nitrocelulose foi bloqueada com leite desnatado a 5% à temperatura ambiente por 1h e submetida a immunoblotting com anticorpos monoclonais de coelho anti‐MMP‐2 humano, anticorpos policlonais de coelho anti‐MMP‐9 humano e anticorpos primários de β‐actina. Após a membrana ter sido lavada três vezes em intervalos de 5min em PBS‐T, foi incubada com IgG‐HRP de cabra anticoelho diluída a 1:2000 por 1h em temperatura ambiente. Após a membrana ter sido lavada três vezes a intervalos de 5 minutos em PBS‐T, os immunoblots foram então visualizados com o equipamento LAS4000 Chemiluminescence Imager (Fijifilm, Tóquio, Japão) com o software associado. Para apresentação, os immunoblots foram abertos no PhotoShop CS2 (Adobe Systems, Mountain View, CA, EUA).

Para determinar os níveis de MMP‐2 e MMP‐9 no carcinoma hipofaríngeo, a análise dos dados foi feita com o software estatístico SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados foram apresentados como média±desvio‐

padrão. O teste t de amostras pareadas foi usado para comparar as diferenças entre os tecidos do carcinoma hipofaríngeo e do pericarcinoma. A análise de variância one‐way foi usada para comparar as diferenças entre os grupos em diferentes estágios clínicos, metástase linfonodal e estágio patológico do tumor. Considerou‐se p <0,05 para indicar diferença estatisticamente significante.

A tabela 2 mostra as características descritivas dos indivíduos do estudo, que incluem 42 pacientes com carcinoma hipofaríngeo e média de 59,45±8,36 anos (47 a 78) e 8 pacientes com pólipos de pregas vocais com média de 55,68±8,27 anos (48 a 75). Dos 42 pacientes com carcinoma hipofaríngeo, 38 (90,48%) eram do sexo masculino e apenas 4 (9,52%) do feminino, com razão de homens para mulheres de até 9,5. De acordo com a classificação TNM, a maioria dos pacientes apresentou tumores grandes (T3+T4; 64,28%) e comprometimento linfonodal (N+; 66,67%). A maioria dos pacientes apresentou doença em estágio avançado (estágio III+IV; 80,95%), enquanto 19,05% apresentaram câncer em estágio inicial (estágioI+II). Todos os pacientes foram diagnosticados patologicamente com carcinoma espinocelular (fig. 1). Histologicamente, 71,43% dos pacientes apresentaram tumores pouco ou moderadamente diferenciados.

Figura 1.

Resultados histopatológicos de pacientes com carcinoma hipofaríngeo (coloração H&E, a barra da escala é de 400μm). A, tecido de pericarcinoma; B, tecido de carcinoma.

(0,2MB).

Preparou‐se o RNA total de 84 amostras de tecidos frescos obtidos de pacientes com carcinoma hipofaríngeo e 8 amostras de tecidos das pregas vocais obtidos dos pacientes com pólipos de pregas vocais. Os perfis de expressão de mRNA dos tecidos acima mencionados foram analisados por RT‐PCR. Para excluir a possibilidade de contaminação por transferência, as reações que continham todos os reagentes de RT‐PCR, inclusive os primers de citocina PCR sem RNA da amostra, foram usadas como controles negativos. Nenhuma contaminação foi detectada. Foram analisadas as expressões de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 nos tecidos. A capacidade de expressão (medida como Intensidade Relativa [IR]/proporção de β‐actina) dos pacientes para MMP‐2 e MMP‐9 foi maior nos tecidos do carcinoma hipofaríngeo do que nos tecidos do pericarcinoma. Não houve expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 nos pólipos de tecidos das pregas vocais (fig. 2). Nos 42 pacientes, 37 tecidos cancerígenos (88,1%) e 34 tecidos de pericarcinoma (81,0%) expressaram mRNA de MMP‐2 (IR 0,509±0,319 e 0,353±0,268, respectivamente; t=2,529, p=0,015); e 35 tecidos de cancerígenos (83,3%) e 30 tecidos de pericarcinoma (71,4%) expressaram mRNA de MMP‐9 (IR 0,461±0,249 e 0,218±0,208, respectivamente; t=4,781, p <0,001). Os tecidos cancerígenos exibiram uma expressão de mRNA com nível mais alto de MMP‐2 e MMP‐9 do que os tecidos de pericarcinoma, e essa diferença foi estatisticamente significante.

Figura 2.

Expressão do mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais, tecidos de pericarcinoma e tecidos polipoides de controle obtidos de pacientes com carcinoma hipofaríngeo e pólipo de cordas vocais de pacientes. (A) Expressão representativa de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais e tecidos de controle polipoides. Os tecidos de câncer mostraram uma expressão de mRNA mais intensa de MMP‐2 e MMP‐9, mas quase não houve expressão em tecidos polipoides de controle (faixa 1, 1kb na escada de DNA; faixa 2, tecido de carcinoma; faixa 3, tecido polipoide de controle). (B) Expressão representativa de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais e tecidos de pericarcinoma. Os tecidos cancerígenos mostraram uma expressão de mRNA com nível mais alto de MMP‐2 e MMP‐9 do que os tecidos de pericarcinoma (faixa 1, 1kb na escada de DNA; faixa 2, tecido de carcinoma; faixa 3, tecido de pericarcinoma). (C) Intensidade relativa da expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos de carcinoma e de pericarcinoma. Os tecidos de carcinoma exibiram níveis mais altos de expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 do que os tecidos de pericarcinoma. (* p <0,05 e ** p <0,01).

(0,14MB).

As expressões de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 foram maiores nos tumores com estágios clínicos mais avançados (MMP‐2: F=4,003, p=0,026, MMP‐9: F=5,501, p=0,008). Especialmente no estágio IV, eram claramente maiores do que nos estágios I+II (fig. 3). Sua intensidade de expressão estava associada à metástase dos linfonodos (estadiamento N) e aumentou com o maior grau de metástase linfática (MMP‐2: F=4,584, p=0,016; MMP‐9: F=4,643, p=0,006) (fig. 4) A expressão de MMP‐2 e MMP‐9 nos tecidos cancerígenos aumentou com o avanço do estágio histopatológico do tumor (MMP‐2: F=3,884, p=0,029, MMP‐9: F=3,783, p=0,032) (fig. 5).

Figura 3.

Expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios clínicos obtidos de pacientes com carcinoma hipofaríngeo. (A) Expressão representativa de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios clínicos. A expressão de MMP‐2 e MMP‐9 estava mais intensa nos estágios clínicos mais avançados (faixa 1, 1kb na escada de DNA; faixa 2, pacientes no Estágio I+II; faixa 3, pacientes no Estágio III; faixa 4, pacientes no estágio IV). (B) Intensidade relativa da expressão do mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios clínicos. Pacientes em estágio avançado exibiram níveis mais altos de expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 do que pacientes em estágio inicial (*p <0,05 e ** p <0,01).

(0,1MB).

Figura 4.

Expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios N obtidos de pacientes com carcinoma hipofaríngeo. (A) Expressão representativa de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios N. A expressão de MMP‐2 e MMP‐9 aumentou com o aumento do estágio N (faixa 1, 1kb na escada de DNA; faixa 2, paciente estágio N0; faixa 3, paciente estágio N1; faixa 4, paciente estágio N2); (B) Intensidade relativa da expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios N. Os pacientes com metástase linfática exibiram níveis mais altos de expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 do que os pacientes no estágio N0 (* p <0,05 e ** p <0,01).

(0,08MB).

Figura 5.

Expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios histopatológicos obtidos de pacientes com carcinoma hipofaríngeo. (A) Expressão representativa de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios patológicos. A expressão de MMP‐2 e MMP‐9 foi reduzida com a melhora do grau de diferenciação (faixa 1, 1kb na escada de DNA; faixa 2, paciente bem diferenciado; faixa 3, paciente moderadamente diferenciado; faixa 4, paciente pouco diferenciado); (B) Intensidade relativa da expressão do mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios histopatológicos. Pacientes pouco diferenciados exibiram níveis mais altos de expressão de mRNA de MMP‐2 e MMP‐9 do que pacientes bem diferenciados (*p <0,05 e ** p <0,01).

(0,11MB).

As expressões proteicas de MMP‐2 e MMP‐9 foram analisadas com o ensaio de western blot. Os resultados mostraram que os níveis de expressão proteica de MMP‐2 e MMP‐9 eram consistentes com a expressão de mRNA em tecidos de carcinoma hipofaríngeo e pericarcinoma. A expressão proteica de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos cancerígenos foi maior do que em tecidos de pericarcinoma. Não houve expressão proteica nos pólipos dos tecidos das pregas vocais (tecidos controle). O nível de expressão proteica de MMP‐2 e MMP‐9 foi significantemente maior nos estágios clínicos do tumor e as metástases dos linfonodos (estadiamento N) mais avançados (fig. 6).

Figura 6.

Expressões proteicas de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais e tecidos de pericarcinoma obtidos de pacientes com carcinoma hipofaríngeo. (A) Expressão proteica representativa de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais e tecidos de controle polipoides. Os tecidos cancerígenos exibiram uma expressão proteica mais intensa de MMP‐2 e MMP‐9, mas quase não houve expressão nos tecidos de controle polipoides (faixa 1, tecido tumoral; faixa 2, tecido de controle polipoide). (B) Expressão proteica representativa de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais e tecidos de pericarcinoma. A expressão das proteínas MMP‐2 e MMP‐9 foi maior nos tecidos tumorais do que nos tecidos de pericarcinoma (faixa 1, tecido tumoral; faixa 2, tecido de pericarcinoma). (C) Expressão proteica representativa de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios clínicos. A expressão proteica da MMP‐2 e MMP‐9 aumentou com nos estágio clínicos mais avançados (faixa 1, pacientes Estágio I+II; faixa 2, paciente Estágio III; faixa 3, paciente Estágio IV). (D) Expressão proteica representativa de MMP‐2 e MMP‐9 em tecidos tumorais de diferentes estágios N. A expressão proteica de MMP‐2 e MMP‐9 aumentou com o aumento do estágio N (faixa 1, paciente N0; faixa 2, paciente N1; faixa 3, paciente N2).

(0,13MB).