De acordo com a literatura, a exposição a pesticidas pode causar alterações na audição humana.1–6 A lesão auditiva geralmente ocorre devido a vários fatores7 e, quando ocorre no âmbito ocupacional no setor primário da economia, pode estar relacionada principalmente a dois fatores: exposição a produtos químicos ototóxicos, como solventes e pesticidas, e também ruídos de máquinas agrícolas. A perda auditiva decorrente da exposição a medicamentos ototóxicos é semelhante à que ocorre em altos níveis de pressão sonora, é neurossensorial, bilateral, simétrica, irreversível em altas frequências e causa danos às células ciliadas da cóclea.8

Os agroquímicos pertencentes à classe dos organofosfatos (OFs) são amplamente usados na agricultura como inseticidas. Entre eles, destaca‐se o diclorvos (2,2‐diclorovinil‐dimetil fosfato – DDVP), usado em campanhas de saúde pública para controle de vetores e como recurso na medicina veterinária no combate aos ectoparasitas9 no setor primário da economia brasileira (agricultura). Os OFs atuam como inibidores da colinesterase e são responsáveis por muitos envenenamentos intencionais ou acidentais.10

Os OFs são importantes para controlar vetores, se considerarmos que o Brasil tem um grande número de casos relatados de dengue, chikungunya e zica. Atualmente o país pode ser considerado o mais afetado pelo mosquito Aedes aegypti.11 Portanto, inseticidas, como os organofosforados, são amplamente usados na saúde pública para controle de vetores. O diclorvos, um OF, também é usado em desinfestações domésticas. Além disso, existe uma preocupação com o seu uso em ambientes internos que pode estar relacionada a fases críticas do desenvolvimento humano. As crianças podem ser expostas a pesticidas, pois tendem a explorar seu ambiente quando brincam, tocam superfícies como o chão,12 e a ter um comportamento “mão à boca”, absorvem mais pesticidas do que os adultos.13

Devido à existência de vários agentes etiológicos que causam perda auditiva ocupacional, como ruído de máquinas e exposição a agentes químicos, há uma dificuldade na correlação dessa patologia auditiva. Além disso, mesmo aqueles que não trabalham diretamente com essas substâncias são expostos a elas e a perda auditiva pode ser multifatorial.7

O estudo em animais expostos somente a pesticidas, isentos de vieses como ruído e vibração, permite a caracterização da perda auditiva e o estudo de seus mecanismos. Na literatura, existem poucos estudos que avaliam a ototoxicidade devido à exposição a agroquímicos em modelos animais e esses costumam usar vias não correlacionadas com a exposição ocupacional, como a injeção intraperitoneal.14–16 Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos ototóxicos baseados na função coclear da exposição subcrônica inalatória a um inseticida organofosforado à base de diclorvós (DBOI) em ratos através de emissões otoacústicas por produto de distorção.

A exposição ao DBOI reduziu significativamente as EOAPD pós‐exposição (p <0,05; teste de Mann‐Whitney) em comparação com as medidas pré‐exposição (fig. 1) nas frequências 8 e 10kHz em ambas as orelhas (p=0,034 e 0,045 na orelha direita e p=0,015 e 0,013 na orelha esquerda, respectivamente). Além disso, o tratamento com cisplatina reduziu significativamente as EOAPD (fig. 1) nas frequências de 12kHz (p=0,006) na orelha direita e 4kHz na orelha esquerda (p=0,032). O grupo controle não apresentou diferença significativa (p> 0,05; teste de Mann‐Whitney) nas avaliações pós‐exposição em relação à pré‐exposição (fig. 1), confirmou‐se a padronização do modelo experimental. Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p <0,05; Kruskal‐Wallis) em relação à variação das medianas pós e pré‐exposição (fig. 2).

Figura 1.

Medianas e intervalos interquartis de amplitudes de EOAPD pré e pós‐exposição ao DBOI, cisplatina (controle positivo para dano auditivo) e água (controle).

(0,17MB).

Figura 2.

Variação das amplitudes (medianas e intervalos interquartis) entre o período pré‐ e pós‐exposição para os grupos controle (água), controle positivo e DBOI.

(0,09MB).

De acordo com o valor de p apresentado na tabela 1, o grupo DBOI apresentou diferença significativa (p <0,05) do grupo controle na frequência de 8kHz na orelha direita e nas frequências de 8kHz e 10kHz na orelha esquerda. Embora na frequência de 10kHz na orelha direita a análise tenha demonstrado diferença entre os grupos (p=0,026, Kruskal‐Wallis), a comparação das médias não identificou quais grupos diferiram dos demais. O grupo cisplatina apresentou diferença significante em relação ao grupo controle na frequência de 8kHz na orelha esquerda e em relação ao grupo DBOI na frequência de 12kHz na orelha direita (tabela 1).

O ganho de massa corporal relativo (média±erro‐padrão) no período foi semelhante (p=0,328; teste t de Student) entre os grupos controle (145,3±5,93%) e o DBOI (154,1±5,91%). Entretanto, os animais de ambos os grupos apresentaram sinais clínicos transitórios, como piloereção e dispneia. Os sinais clínicos (fig. 3) foram mais evidentes no início da exposição (entre 30 e 240 minutos) e nas duas primeiras semanas, mas apenas os animais expostos ao DBOI apresentaram depressão transitória (evidenciada por sonolência e diminuição da resposta a estímulos) que durou até a quarta semana.

Figura 3.

Sinais clínicos.

(0,17MB).

Ao analisar os comportamentos no teste Open Field, os animais expostos ao com DBOI não diferiram do controle em nenhuma das características analisadas (latência para se mover do primeiro quadrante (p=0,765; teste T de amostras independentes), cruzamento externo (p=0,299; teste T de amostras independentes), cruzamentos internos (p=0,569; teste T de amostras independentes), elevação nas patas traseiras (p=0,370; teste T de amostras independentes), limpeza (p=0,145; teste T de amostras independentes) Esses resultados explicam que a atividade locomotora espontânea foi normal e que o tratamento não causou danos aos animais.

O teste Plus Maze (fig. 4) mostra que os animais tratados com controle positivo (Diazepam) passaram mais tempo no braço aberto (p <0,001 Anova one‐way, post‐hoc de Bonferroni). Os animais tratados com controle positivo ficaram menos tempo no braço fechado, mas os animais tratados com DBOI não diferiram do controle positivo (p <0,01 Anova one‐way, post‐hoc de Bonferroni). O tempo gasto no centro do aparelho não mostrou diferença entre os grupos (p=0,112; Anova one‐way, post hoc de Bonferroni). A inclinação da cabeça demonstra novamente a ação ansiolítica do controle positivo (p <0,05; Anova one‐way, post hoc de Bonferroni) e nenhuma diferença entre os grupos DBOI e controle positivo (p>0,05; Anova one‐way, post hoc de Bonferroni).

Figura 4.

Teste Plus Maze.

(0,2MB).

Os valores da colinesterase plasmática foram semelhantes (média±erro‐padrão: controle=5958,0±145,0 U/L; DBOI=5886,0±112,9 U/L, respectivamente, p=0,735; teste t de Student). Não foram encontradas alterações macroscópicas nos órgãos dos animais usados no protocolo experimental.

O presente estudo demonstrou a ototoxicidade induzida pela exposição subcrônica inalatória do produto organofosforado DBOI em ratos, que foi comparável ao dano coclear induzido por cisplatina. O protocolo de avaliação da ototoxicidade usado neste estudo foi consistente, se considerarmos que todos os grupos controle (positivos e negativos) demonstraram os comportamentos esperados. A escolha dos ratos como modelo experimental para o teste de EOAPD do protocolo é consistente com dados da literature, na qual se verificou que a EOAPD foi a avaliação auditiva mais frequentemente usada nos estudos analisados que usaram modelos animais, como ratos.24

O uso de um modelo animal no presente estudo permitiu identificar o desfecho investigado (ototoxicidade resultante da exposição a pesticidas por inalação), controlar possíveis vieses (exposição concomitante ao ruído). Além disso, a via de inalação em uma câmara acusticamente isolada, com uma frequência de exposição alternada que imita o dia útil (5: 2 dias), nos permitiu considerar que os efeitos observados aqui em ratos podem ser comparáveis aos relatados na literatura que envolveram agricultores.3,4,6

Além disso, estudos que avaliaram a função coclear por emissões otoacústicas frequentemente usavam anestésicos, o que foi relatado como uma causa provável de alterações nas respostas das EOAPD.25–27 No presente estudo, foi possível fazer as avaliações sem anestesia, devido à aclimatação prévia dos animais aos instrumentos usados nas avaliações auditivas. Além disso, o achado de ototoxicidade secundária após a exposição dos ratos ao DBOI corrobora estudos anteriores que avaliaram a audição de indivíduos que tiveram contato com pesticidas.6,28 No entanto, estudos em humanos podem apresentar algum viés, devido à dificuldade de isolar completamente o ruído e outros fatores de confusão inerentes à história clínica, como exposição a vibrações, ocorrência de doenças congênitas como toxoplasmose, herpes e rubéola ou até presbiacusia, já que os danos à audição podem ser multifatoriais.7

Os resultados pós‐exposição indicaram que, embora o diclorvos tenha sido um inibidor irreversível da colinesterase, a concentração da enzima no grupo experimental foi semelhante à do grupo controle. Esse fato sugere que níveis de exposição ao DBOI que não causam inibição enzimática significativa têm efeito ototóxico. Embora estudos tenham sugerido a associação entre dano auditivo e exposição a pesticidas,1,2,5,6,15,16 a norma regulatória atual no Brasil29 (NR7) não especifica exames auditivos de referência e sequenciais para trabalhadores expostos a agentes químicos e a exposição a pesticidas é avaliada por testes como o nível de colinesterase. Entretanto, nossos resultados indicam que – mesmo sem alteração nos níveis de colinesterase – houve ototoxicidade devido à exposição ao DBOI.

Em relação aos efeitos do tratamento subcrônico inalatório com DBOI nos testes de comportamento Open Field e Plus Maze, nesta pesquisa demonstramos que o DBOI administrado em ratos Wistar não foi uma droga ansiogênica e não teve impacto na atividade locomotora. No entanto, com outra via de administração (oral), Silva et al. (2017) obtiveram resultados diferentes em seu estudo,30 no qual ratos Wistar foram tratados com clorpirifós (0,01; 0,1; 1; e 10mg/kg/dia) nos dias gestacionais (14‐20). O comportamento da prole masculina foi avaliado nos dias 21 e 70 pós‐natal pelo teste Plus Maze elevado e Open Field. Os resultados demonstraram que a exposição a 0,1; 1; ou 10mg/kg/dia de clorpirifós podia induzir um comportamento ansiogênico, mas esse sinal foi revertido no dia pós‐natal 70.

Os poucos sinais clínicos manifestados pelos animais indicaram que a toxicidade sobre a função coclear, após a exposição ao DBOI, estava presente em um nível no qual os ratos não exibiam toxicidade sistêmica relevante – como no sistema nervoso central (baseado em testes de comportamento) – mas apenas transitório. Os sinais clínicos foram mais frequentes nas primeiras horas de exposição, bem como nas primeiras semanas de exposição, sem aparecimento nas últimas duas semanas, o que sugere uma possível tolerância progressiva à mesma concentração da substância. Além disso, as alterações transitórias foram reforçadas por resultados semelhantes entre os grupos quanto ao desenvolvimento do peso.

A diferença estatisticamente significante entre o grupo controle e o controle positivo para lesão era esperada, uma vez que a ototoxicidade da cisplatina está bem estabelecida na literatura.19,31–36 Além disso, a redução da amplitude das EOAPD entre o grupo experimental e o grupo controle indicou que a exposição à substância OF realmente pode danificar a função coclear dos animais. A alteração dos valores da função coclear antes e após a exposição ao DBOI corrobora a literatura anterior, na qual foram verificadas alterações na morfologia coclear de porquinhos da índia devido à exposição a uma substância OF (0,3mg/kg/dia ou 3mg/kg/dia durante sete dias consecutivos, por via intraperitoneal), com alteração na citoarquitetura das células ciliadas externas.16 Essa hipótese é reforçada pela literatura anterior.37,38 Ela indicou que a exposição a inseticidas pode interagir ao nível coclear.

Embora o teste de EOAPD não avalie a perda auditiva em si, a atividade das células ciliadas externas pode ser referida aqui. Destacamos que a bilateralidade dos danos em 8 e 10kHz no grupo experimental é uma das características da perda auditiva neurossensorial secundária à exposição a substâncias ototóxicas. Além disso, as frequências afetadas em animais expostos ao DBOI são consideradas altas, o que também se assemelha à perda auditiva induzida por agente tóxico. Por outro lado, a ocorrência de perdas nas altas frequências de 8 e 10kHz bilateralmente, mas não em 12kHz, é intrigante e nenhum resultado semelhante foi encontrado na literatura consultada. Isso pode ser justificado pelo fato de que geralmente os estudos com EOAPD1,39 não consideram a frequência de 12kHz e isso pode ocorrer devido à limitação do equipamento utilizado.

O mecanismo da perda auditiva após a exposição aos organofosfatos ainda não foi totalmente elucidado.2 A ototoxicidade secundária a algumas substâncias, como gentamicina e cisplatina, tem sido relacionada a possíveis alterações nas funções antioxidantes nas células sensoriais do órgão de Corti, especialmente nas células ciliadas externas, devido à peroxidação lipídica.40

Este estudo tem potenciais limitações. Embora o teste de potencial evocado auditivo do tronco encefálico (PEATE) seja um melhor indicador da função coclear e presença de deficiência auditiva do que as EOAPD, o teste PEATE não foi feito, uma vez que o equipamento estava em um edifício inacessível aos animais. As EOAPD puderam ser feitas, uma vez que o equipamento é portátil e pode ser levado até o local onde os animais estavam alojados. Além disso, o equipamento da instituição não tinha a função de triagem do PEATE (PEATE‐a). A segunda limitação é a falta de pesquisas anteriores analisando frequências como 10kHz e 12kHz, o que dificulta a comparação de nossos resultados com outros achados (como a diferença estatística em 8kHz e 10kHz no grupo DBOI, mas não a 12kHz). Outra limitação é que a avaliação das EOAPD sem a mensuração de enzimas antioxidantes no sistema auditivo não permite afirmar que a ototoxicidade relacionada ao DBOI poderia ser causada por disfunção nas enzimas antioxidantes; entretanto, sugere que isso possa estar relacionado, pois a diminuição ou ausência de EOAPD pode indicar danos na função das células ciliadas. Para esclarecer completamente esse mecanismo, serão necessários novos estudos de pesquisa funcional, associados a métodos que avaliem as enzimas antioxidantes e a morfologia das células ciliadas, como microscopia eletrônica de varredura ou até microscopia de fluorescência.

O DBOI, inseticida organofosforado à base de diclorvos, causou ototoxicidade nos animais avaliados, comparável ao dano induzido pela cisplatina nas EOAPD, sem efeitos sistêmicos significativos, com perda nas frequências de 8 e 10kHz bilateralmente.

O presente estudo foi financiado em parte pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), Código Financeiro 001.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.