A pesquisa foi feita no Surgery Research and Application Center com aprovação do comitê de ética local de experimentação animal sob o número de protocolo 2017/23. Vinte e sete coelhos machos da Nova Zelândia com nervos faciais bilaterais normais, cada um com peso entre 2.000‐3.000g, foram mantidos em condições padrão (21‐22° C, ciclo claro/escuro de 12 horas) sem restrições de alimentação ou água. Os animais experimentais foram divididos aleatoriamente em três grupos: Grupo 1, o grupo simulação (n=7); Grupo 2, o grupo de sutura (n=10); e Grupo 3, o grupo sutura+T‐FRP (n=10).

Profilaticamente, 20–40mg/kg de cefazolina sódica foram administrados por via intramuscular aos animais uma hora antes e uma hora após o procedimento. A anestesia geral foi fornecida com cloridrato de cetamina 35mg/kg e cloridrato de xilazina 5mg/kg por via intramuscular.

O procedimento experimental foi feito no nervo facial direito de cada animal. Após limpeza da área cirúrgica com solução de iodopovidona a 10%, foi feita uma incisão pré‐auricular direita de aproximadamente 5cm através da pele e do tecido subcutâneo. A parte massetérica do músculo esfíncter superficial do pescoço foi cruzada e o ramo bucal do nervo facial tornou‐se visível acima do músculo masseter. O ramo bucal foi seguido em direção à parte proximal. O tronco do nervo facial foi identificado entre o ponto de saída do forame estilomastóideo e a região de bifurcação.

Após a exposição e dissecção do nervo no Grupo 1, a pele foi suturada com fio de seda 4.0 (ipek/seda USP 4/0, Doğpa Tıbbi Malzeme Tic. A.Ş., Turquia) sem qualquer tratamento. No Grupo 2, foi feita uma secção transversal do tronco nervoso com microscópio cirúrgico e instrumental microcirúrgico (fig. 1a). O tronco nervoso foi então suturado com microsutura 9.0 (Daylon® USP 9/0, Doğpa Tıbbi Malzeme Tic. A.Ş., Turquia) e duas suturas epineurais foram feitas a 0 e 180 graus (fig. 1b). No Grupo 3, após a transecção e sutura do nervo com microssutura 9.0, como feitas no Grupo 2, o T‐FRP foi envolvido em torno do nervo de cada animal em formato de tubo acima da área suturada (fig. 1c‐d).

Figura 1.

(a) Incisão de espessura total no tronco do nervo facial; (b) Sutura de terminações nervosas; (c) Encaixe da membrana de FRP; (d) Membrana de FRP ao redor do tronco do nervo facial.

(0,35MB).

Para cada animal do Grupo 3, 10mL de sangue foram removidos da artéria marginal direita ou esquerda da orelha. O sangue coletado foi rapidamente transferido para dois tubos de titânio de 5mL e centrifugado a 3.500rpm por 15 minutos em temperatura ambiente com uma centrífuga de mesa (NF 400, Nuve, Turquia).10 Após a centrifugação, o coágulo (T‐FRP) obtido foi retirado dos tubos de titânio com pinça estéril. O coágulo resultante foi separado dos glóbulos vermelhos, esmagado entre compressas de gaze e transformado em uma membrana.

Após a cirurgia, o movimento dos bigode, a queda da orelha e o reflexo da córnea de cada animal foram registrados semanalmente pelo mesmo observador. A avaliação do reflexo da córnea usou a escala de classificação de 5 pontos identificada por Borin et al.:11 0, nenhum movimento de fechamento visível; 1, estreitamento da fenda palpebral menor do que 1/3; 2, estreitamento da fenda palpebral entre 1/3 e 2/3; 3, estreitamento da fenda palpebral superior a 2/3; 4, fechamento do olho completamente ao tocar a córnea.

O movimento do bigode e a queda da orelha foram avaliados semanalmente como presentes ou não.

Foram feitos seis exames de eletromiografia (EMG) facial bilaterais, antes da cirurgia e na 1ª, 3ª, 5ª, 7ª e 10ª semanas de pós‐operatório pela mesma pessoa. Anestesia foi aplicada a todos os animais durante o procedimento. Um estímulo foi dado com um módulo estimulador BSLSTM (BIOPAC® Systems Inc., EUA) na linha do tronco do nervo facial abaixo do forame estilomastoideo com um eletrodo de duas sondas. O nível de limiar de alerta supramáximo foi determinado aumentando‐se a intensidade de alerta em unidades de 1 volt. As amostras foram obtidas com eletrodos de agulha de três pontos de músculos mímicos na área dos bigodes. O software Biopack Student Lab Pro 3.7.7. e o hardware Biopack MP36 (BIOPAC® Systems Inc., EUA) foram usados para o registro.

A quantidade de estímulo dada para determinar o nível de limiar de alerta do nervo facial, valores de amplitude máxima do potencial de ação muscular composto (PAMC) e velocidade de condução nervosa foram medidos.

Todo o tronco do nervo facial direito do animal foi dissecado dos tecidos circundantes sob anestesia para avaliação histopatológica. O tronco foi removido a 5mm proximal e 5mm distal à região da incisão. O tronco do nervo facial esquerdo (isto é, que não foi submetido ao procedimento cirúrgico) foi exposto e uma parte que media 1cm foi excisada. Em seguida, a eutanásia de todos os animais foi feita por exsanguinação através de uma incisão na artéria carótida direita ou esquerda.

Os tecidos foram fixados em formaldeído a 10% por 48 horas para análise por microscópico óptico. Após a fixação, os tecidos foram lavados em água corrente por 24 horas. Após serem submetidos a soluções de álcool de grau crescente (70%, 90%, 96%, 100%) para desidratação, foram submetidos a clarificação com solvente xileno e embebidos em blocos de parafina. Com a ajuda de um micrótomo totalmente automatizado (LEICA RM 2255, Tóquio, Japão), os blocos de parafina foram aparados em lâminas de 10μm até que o tecido fosse alcançado e seções de 5μm foram retiradas do tecido. A coloração com hematoxilina e eosina foi usada para observar a estrutura histológica geral.

Congestão vascular, edema, vacuolização, acúmulo de colágeno, degeneração de mielina e axônio, continuidade axonal, células inflamatórias, fibrose e proliferação de células de Schwann foram avaliadas semiquantitativamente (para continuidade axonal 1: contínua, 2: moderada, 3: fraca; para proliferação de células de Schwann 0: nenhuma, 1: grave, 2: moderada, 3: leve; para outros parâmetros 0: nenhum, 1: leve, 2: moderado, 3: grave). Um microscópio óptico (Olympus® BX 51, Japão) com câmera digital acoplada (Olympus® DP 71, Japão) foi usado para tirar fotos e fazer medidas com aumento de 40x. A espessura da bainha de mielina foi medida com o program Olympus Database Manual cellSens Life Science Imaging Software, versão 510_UMA _Database_cellSens19‐Krishna‐en‐00.

Todos os dados foram analisados com o programa estatístico SPSS 22.0. O teste de Wilcoxon e a análise de variância de Kruskal‐Wallis foram usados na avaliação histopatológica. A análise post hoc foi feita com o teste U de Mann‐Whitney e os valores de p obtidos na análise post hoc foram interpretados com a correção de Bonferroni. O teste t de Student, a análise de variância bidirecional e a análise de variância de medidas repetidas foram usados na avaliação fisiológica. O teste de Dunnett foi usado para o cálculo post hoc da análise de variância bidirecional; o valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significante.

No Grupo 1, os reflexos da córnea não diferiram entre antes e depois da cirurgia. Nas semanas seguintes à cirurgia nos Grupos 2 e 3, observou‐se melhoria do reflexo corneal. Nos seguimentos semanais, não houve diferença estatisticamente significativa no reflexo da córnea entre esses dois grupos.

No Grupo 2, houve queda na orelha direita em todos os animais nas primeiras três semanas. A queda da orelha começou a apresentar melhoria na semana 4 e melhorou todos os animais na semana 7. No Grupo 3, a queda da orelha direita começou a melhorar na semana 3 e apresentou melhoria completa na semana 5.

No Grupo 2, movimento perceptível do bigode foi registrado a partir da semana 9. Por outro lado, isso foi observado a partir da semana 8 no Grupo 3. Na semana 10, o movimento dos bigodes foi verificado em sete dos oito animais do Grupo 2 e em 8 dos dez indivíduos do Grupo 3.

Os limiares de alerta do lado direito foram significativamente maiores nos Grupos 2 e 3 em comparação com o Grupo 1 até a semana 10. Esses valores não diferiram significantemente entre o Grupo 2 e o Grupo 3, exceto na 3ª semana de pós‐operatório (tabela 1).

Após a incisão no lado direito do Grupo 2, o limiar de alerta aumentou substancialmente. O valor aumentado do limiar após a incisão não foi diferente dos valores de controle na 7ª semana de pós‐operatório nesse grupo. No Grupo 3, o valor aumentado do limiar após a incisão não diferiu dos valores de controle na 5ª semana de pós‐operatório. O limiar de alerta do Grupo 3 foi recuperado duas semanas antes do que no Grupo 2 (tabela 2, fig. 2).

Figura 2.

Médias dos valores do limiar de alerta dos grupos experimentais. * Significantemente diferente comparado ao Grupo 1 (p <0,05). # Significantemente diferente comparado com a semana pré‐operatória (p <0,05). ◊ Significantemente diferente comparado ao lado esquerdo (p <0,05); • Significantemente diferente comparado ao Grupo 2 (p <0,05).

(0,16MB).

Os valores de amplitude máxima de PAMC obtidos no lado direito diminuíram após a cirurgia nos Grupos 2 e 3. Esses valores foram significantemente menores do que no grupo simulação e seus valores de controle do pré‐operatório em todas as semanas (p <0,05). Os valores de amplitude máxima de PAMC no lado direito nos Grupos 2 e 3 não diferiram significantemente no seguimento semanal pós‐operatório (tabela 3, fig. 3).

Figura 3.

Valores de amplitude máxima do PAMC nos grupos experimentais. * Significantemente diferente comparado ao Grupo 1 (p <0,05). # Significantemente diferente comparado com a semana pré‐operatória (p <0,05). ◊ Significantemente diferente comparado com o lado esquerdo (p <0,05).

(0,18MB).

Da mesma forma, os valores de amplitude de PAMC no lado direito obtidos por estimulação supralimiar diminuíram após a cirurgia nos Grupos 2 e 3. No Grupo 2, esse valor não foi significantemente diferente de seus valores pré‐operatórios na semana 10 (p=0,478). No grupo 3, essa diminuição significativa do estado pré‐operatório persistiu ao longo de todas as semanas (p <0,05). Esses valores não diferiram significantemente nos seguimentos semanais pós‐operatórios nos Grupos 2 e 3 (tabela 4, fig. 4).

Figura 4.

Valores da amplitude de potencial de ação muscular composto desencadeados por estimulação acima do limiar. *Significantemente diferente comparado ao Grupo 1 (p <0,05). # Significantemente diferente comparado com a semana pré‐operatória (p <0,05). ◊ Significantemente diferente comparado ao lado esquerdo (p <0,05).

(0,18MB).

Não foi observada diferença significativa entre os Grupos 2 e 3 em relação aos valores da velocidade de condução nervosa antes e após a cirurgia (tabela 5, fig. 5).

Figura 5.

Velocidade de condução nervosa nos grupos experimentais. *Significantemente diferente comparado com o Grupo 1 (p <0,05). # Significantemente diferente comparado com a semana pré‐operatória (p <0,05).

(0,18MB).

Menos vacuolização e edema foram observados semiquantitativamente no Grupo 3 do que no Grupo 2, mas essa diferença não foi estatisticamente significante. Nos Grupos 2 e 3, os achados de congestão vascular, infiltração de colágeno, células inflamatórias, vacuolização, edema, fibrose, proliferação de células de Schwann, degeneração da mielina e degeneração axonal foram significativamente maiores do que no Grupo 1; a continuidade axonal e a espessura da bainha de mielina foram nitidamente menores (tabela 6). Não houve diferença significante entre o lado direito do Grupo 2 e do Grupo 3 em relação a esses parâmetros.