O grupo de estudo consistiu em 346 pacientes consecutivos, com média de 21,8±19,9 anos (0,16‐84 anos), inclusive 176 homens e 170 mulheres, com PA neurossensorial de 30dB ou mais (calculada como o limiar auditivo médio a frequências relevantes para a fala ‐ 0,5; 1; 2 e 4kHz), nos quais foram feitos testes genéticos para identificar as mutações em GJB2 e GJB6. A PA foi confirmada por audiometria tonal pura ou, no caso de crianças com menos de 6 anos, com potencial evocado auditivo do tronco cerebral (BERA). Entre os indivíduos estudados, 91 tinham implantes cocleares.

O DNA foi extraído do sangue periférico por meio de um procedimento de salting‐out.13 A tipagem para a mutação c.35delG no gene GJB2 foi feita por dois métodos independentes: AS‐PCR e PCR‐RFLP, tal como descrito anteriormente.14,15 Em resumo, foi feita a amplificação multiplex de três regiões de GJB2 (c.12‐72, c.68‐198 e c.306‐464) com primers marcados fluorescentes. Em paralelo, foi feita análise de PCR‐RFLP específica para mutação c.35delG. O tamanho dos fragmentos gerados pelos dois protocolos anteriormente mencionados foi determinado por meio de um analisador genético 3500XL (Life Technologies), com um software mapeador genético (Life Technologies). As amostras que não tinham duas mutações c.35delG foram ainda analisadas por sequenciação direta do DNA do exon 2 amplificado por PCR do gene. A análise da sequência foi feita com o software Variant Reporter v1.1 (Life Technologies). A genotipagem da mutação c‐23+1G>A de GJB2 foi feita com PCR em tempo real, de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies), enquanto a mutação de GJB6 del (GJB6‐D13S1830) foi detectada com o método de del Castillo et al.16 A nomenclatura genética está alinhada com as recomendações da Human Genome Variation Society (HGVS).

Todos os 346 pacientes foram submetidos a eletrocardiograma (ECG) de 12 derivações. O registro do ECG foi feito e avaliado com o sistema Sentinel Cardiology Information Management (Reynolds Medical). As durações de intervalo PR, complexo QRS e intervalo QTc foram medidas por um único observador, em uma imagem aumentada 5 vezes em um monitor de computador com uma precisão de cursor de 1ms (frequência de amostragem 1000Hz). O intervalo PR foi geralmente medido em derivação II, complexo QRS em V1 e/ou V5, e intervalo QT em pelo menos três derivações do mesmo ciclo (geralmente derivações II, V2 e V5). A frequência cardíaca foi calculada a partir do intervalo RR que precede o ciclo do intervalo QT medido. Para corrigir o intervalo QT devido à frequência cardíaca (isto é, QTc), a fórmula de Bazett foi usada para frequências entre 50 e 120 bpm; para frequências mais rápidas ou mais lentas, foi usada a fórmula de Hodges. Para calcular QTc médio, foram excluídos os pacientes com complexos QRS ≥ 120ms. Um intervalo QTc acima de 460ms nas mulheres, 450ms nos homens e 440ms em crianças com menos de 14 anos foi diagnosticado como prolongado.

A população do estudo foi dividida em três grupos, com base em valores de referência do QTc para crianças, mulheres e homens,17 ficaram 147 crianças<14 anos (42,4% dos pacientes), 100 mulheres ≥ 14 anos (28,9%) e 99 homens ≥ 14 anos (28,6%). O grupo de crianças incluiu 70 (47%) meninas.

A análise estatística de cada um dos três grupos envolveu um teste de Kruskal‐Wallis e o teste de duas amostras de Wilcoxon.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Bioética, número KB/05/2009. O estudo foi feito em conformidade com os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os pacientes ou seus responsáveis forneceram consentimento escrito para participar.

As mutações em GJB2 foram identificadas em 112 (32%) pacientes com PA. Nenhuma mutação foi detectada nos genes GJB2 e GJB6 analisados nos outros 234 (68%) pacientes.

A idade média de crianças com uma mutação GJB2 e crianças sem mutação GJB2 foi semelhante (6,0±4,6 vs. 5,8±4,5 anos, p=0,86). A idade média dos adultos nos dois grupos (com e sem mutação de GJB2) também foi semelhante (35,1±17,6 vs. 30,5±16,5 anos, p=0,17 para as mulheres; 31,6±18,9 e 30,3±17,5 anos, p=0,99 para os homens) (tabela 1).

O genótipo homozigoto c.[35delG];[(35delG)] no gene GJB2 foi detectado em 72 (20,8%) indivíduos. Em 40 (11,8%) indivíduos, foram identificados genótipos GJB2 heterozigotos: c.[35delG]; [=] (n=15), c.[35delG (;) 313_326del] (n=5), c.[35delG (;) ‐23+1G>A] (n=4), c.[313_326del];. [=] (n=2), c.[35delG (;) 551G>C] (n=2), c.[35delG (;) 95G>a] (n=2), e um genótipo heterozigoto composto de GJB2 e GJB6 [GJB2:c.35delG]; [GJB6:del(GJB6‐D13S1830)] (n=2). Os seguintes genótipos heterozigotos de GJB2 ocorreram em casos individuais: c.[35delG(;) 269T>C], c.[148g>A]; [=], c.[79g>A; 341G>A; 269T>C], c.[101T>C];. [=], c.[35delG.(;)235delC], c.[35delG.(;)358_360delGAG], c.[35delG.(;)139g>T], c.[334_335delAA]; [=] (tabela 2).

A próxima fase do estudo foi comparar parâmetros eletrocardiográficos na população estudada. Os parâmetros medidos foram comparados entre os dois grupos: o grupo de pacientes com uma mutação no gene GJB2 (ambos homozigotos e heterozigotos) e o grupo de pacientes sem mutação no gene. Não foram encontradas diferenças significativas para qualquer parâmetro medido em qualquer um dos grupos estudados. A tabela 3 apresenta as diferenças intergrupos no intervalo PR; a tabela 4 apresenta as diferenças intergrupos no complexo QRS; e a tabela 5 apresenta diferenças intergrupo no intervalo QTc.

Além disso, foram comparados os parâmetros em pacientes com PA profunda causada por uma mutação de GJB2 de genótipo homozigoto c.[35delG];[(35delG)] e naqueles com um genótipo heterozigoto [GJB2: c.35delG];[GJB6: del(GJB6‐D13S1830)] vs. todos os outros pacientes com outros tipos de PA. A análise não revelou diferenças significativas (tabela 6).

Finalmente, analisou‐se a incidência de anomalias no ECG no grupo de pacientes com uma mutação no GJB2 e naqueles sem qualquer mutação deste gene. As anormalidades no grupo de pacientes com uma mutação foram: ritmo atrial (dois pacientes), bradicardia sinusal (n=12), condução atrioventricular de tempo curto (n=3), bloqueio fascicular anterior esquerdo (n=1), intervalo QTc acima da norma para a idade e sexo (n=10) e sinais de necrose da parede inferolateral do miocárdio associados ao prolongamento do QTc (n=1). No grupo de pacientes sem qualquer mutação, as anormalidades foram: bradicardia sinusal (n=25), ritmo atrial (n=3), marcapasso atrial migratório (n=1), tempo curto de condução atrioventricular (n=2), bloqueio atrioventricular de primeiro grau (n=5), bloqueio de ramo incompleto direito (n=1), bloqueio fascicular anterior esquerdo (n=1), bloqueio de ramo completo (n=7), distúrbios da condução intraventricular (n=3), sinais de hipertrofia ventricular esquerda (n=3), sinais de isquemia do miocárdio (n=2) e prolongamento do QTc (n=23). Em um menino, havia ritmo supraventricular com um tempo de condução atrioventricular prolongado, distúrbios de condução intraventricular inespecíficos e sinais de hipertrofia ventricular direita.

No grupo de pacientes com mutação de GJB2 e QTc prolongado (n=10), o intervalo QTc médio foi de 463,2±15,6ms, enquanto nos pacientes com prolongamento do QTc e sem qualquer mutação (n=23), o intervalo QTc médio foi de 460,3±12,8ms. Essa diferença também não foi significativa (p=0,69).

Nosso estudo teve algumas limitações. Diferentes expressões fenotípicas são resultado de várias mutações de GJB2. Como as mutações do gene GJB2 descritas que resultam em PA são recessivas, comparamos os parâmetros de um grupo de pacientes com um genótipo homozigótico c.[35delG];[(35delG)] e um heterozigótico [GJB2: c.35delG];[GJB6:del(GJB6‐D13S1830)] com todos os outros pacientes. Os resultados dessa análise são limitados pelo pequeno número de pessoas com um genótipo homozigótico c.[35delG];[(35delG)] e havia apenas duas crianças com genótipos heterozigotos [GJB2: c.35delG];[GJB6:del (GJB6‐D13S1830)] dando o efeito fenotípico da surdez.

No grupo de estudo, a presença de defeitos cardíacos não foi descartada por um teste confiável (p.ex., ecocardiografia) e nem tampouco o efeito de determinados medicamentos que podem ter influenciado parâmetros eletrocardiográficos. O grupo de estudo foi selecionado pela triagem de indivíduos com PA que não relataram sintomas de doença cardíaca ou não tomavam medicamentos, o que produziu um grupo aparentemente saudável que apresentava PA.