A perda auditiva afeta aproximadamente 360 milhões de pessoas em todo o mundo, com grande impacto nos relações e na capacidade de comunicação. Embora o ruído seja o principal fator de risco evitável para danos auditivos, estima‐se que 10% da população humana estejam expostos a pressão sonora excessiva, a níveis que possam induzir lesão auditiva. A perda auditiva induzida por ruído (PAIR) é a doença ocupacional mais prevalente nos EUA, com 22 milhões de trabalhadores expostos a altos níveis de ruído, demanda US$ 240 milhões em tratamento de perda auditiva.1–3 Muitas estratégias terapêuticas para tratar ou prevenir a PAIR foram investigadas. Terapias antioxidantes têm mostrado sucesso na prevenção do estresse oxidativo induzido pela exposição ao ruído em modelos animais.3 A Food and Drug Administration tem recomendado estudos sobre opções de tratamento administrados por via oral para doenças auditivas.4,5

Um alto nível de exposição ao ruído promove intensa atividade metabólica na cóclea, o que induz estresse oxidativo associado a danos transitórios ou permanentes nas células ciliadas cocleares.4,6,7 Para proteção contra situações de ruído, a cóclea requer uma resposta citoprotetora, na forma da expressão de uma família de proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSP70). O HSPA1A é o gene de resposta de choque térmico (HSR) mais estudado, devido à sua alta expressão em células de mamíferos sob condições de estresse. Está localizado na região do complexo principal de histocompatibilidade (MHC – Major Histocompatibility Complex) III e codifica uma forma induzível de 72 kDa (HSP72). Em estudos com camundongos submetidos a pré‐condicionamento com choque térmico, a expressão dessas proteínas aumentou, o que forneceu proteção contra danos auditivos induzidos por ruído; isso enfatiza a importância da expressão de HSP70.8 Além disso, a supressão do fator de choque térmico 1 (HSF1), o fator de transcrição necessário para a síntese de HSP72, mostrou resultar em perda auditiva permanente após exposição ao ruído.9

Vários estudos avaliaram métodos para induzir o HSR na cóclea e o papel citoprotetor da HSP70.10–14 A glutamina é um aminoácido avaliado como potencializador da HSR, tanto em estudos in vitro como in vivo.15,16 A influência da glutamina ou do dipeptídeo de alanil‐glutamina (DIP) na defesa antioxidante intracelular devido ao aumento dos níveis de glutationa17 e a presença dos transportadores de glutamina nas células ciliadas da cóclea sugerem que a suplementação com glutamina pode ser importante para a saúde auditiva em indivíduos expostos ao ruído.18

A HSP72 intracelular (iHSP72) atua como um protetor molecular de outras proteínas (limita assim a agregação de proteínas, facilita a reativação de proteínas e mantém a função estrutural) e tem propriedades anti‐inflamatórias, através da inibição da ativação do fator nuclear kB (NF‐kB).19 Por outro lado, um número crescente de observações indica que, quando localizadas no meio extracelular (eHSP72), essas proteínas podem afetar células adjacentes ou distantes.20,21 A eHSP72 é capaz de promover interações moleculares com os receptores da superfície celular e, assim, promover a sinalização celular pró‐inflamatória através da interação com vários receptores de eHSP72. A esse respeito, a liberação de eHSP72 para o meio extracelular pode ser caracterizada como um estado pró‐inflamatório, enquanto a expressão intracelular de iHSP72 representa um papel anti‐inflamatório mais amplo. Com base nessas observações, a razão eHSP72/iHSP72 (índice H) foi estabelecida, na qual [eHSP72/iHSP70] no estado basal é 1: 1=1 (isto é, grupo controle) representa uma condição normal.22–24 Que seja de nosso conhecimento, o índice H nunca foi usado em estudos de perda auditiva. No presente estudo com ratos, investigamos se a exposição ao ruído pode induzir a HSR localmente na cóclea (iHSP72) e sistemicamente (eHSP72). Também avaliamos se a suplementação com DIP pode modificar a HSR e prevenir a perda auditiva. Nossa hipótese é que os níveis plasmáticos de eHSP72 e/ou o índice H podem ser usados como biomarcadores do estresse auditivo após a exposição ao ruído.

Antes de qualquer intervenção, todos os ratos apresentaram um limiar auditivo próximo a 20dB (fig. 2A). A exposição ao ruído promoveu um aumento de 40dB no limiar auditivo nos grupos PAIR e DIP+PAIR (fig. 2 A ‐ B).

Figura 2.

Efeitos do dipeptídeo alanil‐glutamina (DIP) na perda auditiva induzida por ruído (PAIR). (A) Limiar da audição e (B) Desvio do limiar auditivo. PAIR e DIP+PAIR mostraram um aumento no limiar auditivo (* p<0,05 vs. mesmo grupo antes da exposição ao ruído) e desvio do limiar auditivo (** p<0,05 vs. grupos sem exposição ao ruído).

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A exposição ao ruído (14 dias) induziu um aumento nos níveis cocleares do iHSP70 (grupo PAIR) quando comparado ao grupo controle (fig. 3A), enquanto os níveis do iHSP70 no complexo nuclear coclear permaneceram inalterados (fig. 3B). Os níveis de eHSP72 aumentaram devido à exposição ao ruído e esse efeito foi atenuado pelo tratamento com DIP (fig. 3C).

Figura 3.

Efeitos do tratamento com o dipeptídeo de alanil‐glutamina (DIP) na resposta de choque térmico em perda auditiva induzida por ruído (PAIR). (A) A PAIR promoveu um aumento na expressão de iHSP72 coclear (*p <0,05 vs. controle). (B) Nenhuma alteração foi observada na expressão do iHSP72 no complexo nuclear coclear. (C) As concentrações de eHSP72 no plasma foram maiores no grupo PAIR do que todos os grupos combinados (**p <0,05).

(0,06MB).

Após a exposição ao ruído, foi avaliado o estado do choque térmico na razão eHSP70/iHSP70 (índice H). Observaram‐se aumentos tanto na razão HSP70 plasma/coclear (fig. 4A) como na razão HSP70 do complexo nuclear coclear/plasma (fig. 4B). O tratamento com DIP removeu esses efeitos e resultou em níveis do índice H, nas razões plasma/coclear e plasma/complexo nuclear coclear que eram similares aos do grupo controle.

Figura 4.

Efeitos do tratamento com dipeptídeo de alanil‐glutamina (DIP) na perda auditiva induzida por ruído (PAIR) e na razão eHSP72/iHSP72 (índice‐H). (a) Razão HSP70 plasma/coclear e (b) razão plasma/complexo coclear nuclear do HSP70. A PAIR promoveu um aumento tanto na razão plasma/coclear quanto na razão plasma/complexo coclear nuclear de eHSP72/iHSP72 (* p <0,05 vs. todos os grupos).

(0,08MB).

Este estudo relata a primeira evidência de que o dano coclear induzido pela exposição ao ruído é acompanhado por HSR local e sistêmica e a suplementação com DIP pode atenuar os marcadores de estresse em um modelo de PAIR em ratos. Observamos também que o tratamento com DIP não evita a perda auditiva, apesar das reduções nos níveis de marcadores de estresse.

O modelo de PAIR em ratos foi baseado em um estudo anterior, no qual a perda de audição foi induzida com 124dB NPS por 2h.28 Esse diferiu do nosso estudo no uso de ratos Sprague‐Dawley e o pico de intensidade sonora foi estabelecido a uma frequência de 4000Hz. O presente estudo também usou um estímulo clique para o Peate. Estímulos de clique e de tom puro são comumente usados em investigações dessa natureza. O estímulo clique tem alta reprodutibilidade e estabilidade da forma de onda e é um dos estímulos mais comuns usados em estudos clínicos. Em humanos, a avaliação auditiva com cliques produz um espectro de frequência de 2000–4000Hz, comparado a 8000‐10.000Hz em ratos. Uma possível explicação para essa diferença é a diferença anatômica entre as orelhas humanas e de ratos.29 Em nosso estudo, o estímulo clique foi adequado para avaliação coclear devido à sua excelente reprodutibilidade. Devido à correspondência espectral (8000–10000Hz) do estímulo clique, uma intensidade sonora de pico de 124dB NPS foi escolhida a 8000Hz. Mesmo com as diferenças entre esses estudos, ambos os conjuntos de resultados demonstraram alterações semelhantes no limiar auditivo de aproximadamente 40dB, 14 dias após a exposição ao ruído.

A HSR tecidual é necessária para a manutenção de um estado inflamatório balanceado, devido aos papéis citoprotetores e anti‐inflamatórios da expressão da iHSP70. Isso é essencial para a homeostase proteica (proteostase) contra exposições ao ruído prejudiciais, como o estresse oxidativo.30 Vários estressores são capazes de induzir a expressão da iHSP70 na cóclea de roedores, inclusive choque térmico corporal,8 hipertermia local,31 isquemia transitória,32 ototoxicidade da cisplatina33 e altos níveis de exposição ao ruído.8,10,34 O papel da iHSP70 em situações de estresse sonoro foi investigado por Fairfield et al.9 e Gong et al.35 Ambos os grupos mostraram a importância do fator de choque térmico 1 (HSF1) o principal fator de transcrição da família HSP70, na prevenção e reparo de danos cocleares após intensa exposição ao ruído em camundongos knockout hsf ‐ / ‐.9,35 A HSR iniciou‐se logo após a exposição ao ruído (106dB NPS por 2h), com um pico de expressão de RNAm de HSP70 após 4h. 35 Demonstramos, pela primeira vez, uma persistente resposta ao estresse do sistema auditivo após exposição ao ruído. Os ratos do grupo PAIR exibiram aumentos sustentados nos níveis de iHSP70 durante 14 dias após a exposição ao ruído. Entretanto, o tratamento com DIP não resultou na potencialização de iHSP70 no complexo nuclear coclear ou cóclea e, portanto, não conseguiu evitar a perda auditiva; isto é, a dose posológica, a frequência e o período de tratamento do DIP não levaram a melhorias na HSR quando comparado aos ratos controle. A falha em iniciar uma HSR robusta sob situações de estresse é um sério comprometimento da função celular.22,36

O InterAcademy Medical Panel recomenda a prevenção e o tratamento da PAIR.1 Assim, investigamos o efeito da suplementação com DIP na perda auditiva. L‐glutamina é o aminoácido livre mais abundante no corpo, nutricionalmente classificado como um aminoácido não essencial. Como a glutamina é o precursor imediato do glutamato, a síntese de novo da glutationa pode aumentar com o tratamento com DIP e fornecer uma defesa antioxidante adicional nos espaços intracelulares17,37 e assim evitar danos por estresse oxidativo.38 Esses efeitos foram observados em estudos que administraram as mesmas doses de DIP (1,5g/kg) usadas em nosso estudo.39,40 Apenas alguns estudos investigaram o metabolismo coclear da glutamina. Ryan e Schwartz41 rastrearam a captação de glutamina em células ciliadas da cóclea e observaram níveis mais altos nas células ciliadas internas do que nas externas. Esse fato sugere a existência de um sistema de membrana de alta afinidade para o transporte de glutamina na cóclea. Além disso, o glutamato é o principal neurotransmissor usado pela sinalização auditiva da cóclea, principalmente pelas células ciliadas internas. Consequentemente, essas células são ricas em enzimas glutaminase.42 As membranas pré‐sinápticas dendríticas expressam grandes quantidades de receptor de glutamato ácido α‐amino‐3‐hidroxi‐5‐metil‐ 4‐isoxazol‐propiónico (AMPA) SAT1 (alternativamente denominado GlnT, SA2, SNAT1 e ATA1), um membro da família de transportadores de aminoácidos neutros (SLC38). Tem afinidade preferencial pela glutamina e transporta esse aminoácido da endolinfa (espaço extracelular) para as células ciliadas internas para a síntese do glutamato.18

Os efeitos protetores da glutamina estão associados à potencialização da HSR, pois ela pode promover um ligeiro aumento na trimerização do Heat Shock Factor 1 (HSF‐1), um passo necessário para a HSR. No entanto, em situações de desafio, como o choque térmico, a glutamina aumenta a ativação do HSF1 e, consequentemente, a síntese da HSP70.37 A ativação da via de glicosilação ligada à O (O‐GlcNAc) pela glutamina pode promover a fosforilação recíproca,15 o que leva à translocação nuclear de HSF1 para a região do Heat Shock Element (HSE) que é responsável pela expressão da família HSP70.16

Esses fatores reforçam a hipótese de que a suplementação com DIP é benéfica para o sistema auditivo, com papéis na sinalização, antioxidante e defesa contra estresse celular. Embora a suplementação com DIP (com 1,5g/kg) possa promover um aumento de 62% na concentração plasmática de glutamina,17 a dose de DIP necessária para melhorar a função e proteção das células cocleares não está clara.38 Além disso, o tempo de evolução da HSR coclear sob estresse acústico requer uma investigação mais profunda, especialmente porque a HSR rápida foi observada após 4h e mantida durante os 14 dias do estudo.

Um aspecto crucial da fisiologia da HSP70 é a versatilidade e dualidade dessas proteínas. A iHSP70 atua como agente anti‐inflamatório e inibe a ativação de fatores de transcrição nuclear do intensificador da cadeia leve Kappa de células B ativadas (κB, família; NF‐κB) em múltiplos níveis regulatórios.37 Em contraste, a eHSP70 tem uma função oposta. Ela sinaliza a presença de desafios homeostáticos para sistemas fisiológicos, após a ligação a receptores Toll‐like (TLR‐2, ‐4 e ‐7) em uma variedade de células.19 Isso leva à ativação das vias pró‐inflamatórias.43 Desde a descoberta da eHSP70 no sistema circulatório, muitas associações entre os níveis da eHSP70 e mau prognóstico em pacientes têm sido descritas em diversas doenças, geralmente relacionadas ao estresse oxidativo. A liberação da eHSP70 ocorre através de várias vias. Acredita‐se que a HSP70 seja encontrada no plasma como resultado de um processo ativo, como sinalização de perigo, ou por morte celular necrótica passiva.21 Pela primeira vez, demonstramos que os efeitos nocivos da exposição ao ruído podem ser detectados por um aumento nos níveis plasmáticos de eHSP72. Além disso, a diminuição nos níveis de eHSP70 pode facilitar o desenvolvimento de terapia baseada em DIP para o tratamento da perda auditiva.

Avaliamos os níveis de iHSP70 na cóclea e no complexo nuclear coclear e níveis plasmáticos de eHSP70 com um kit Elisa de alta sensibilidade. Supôs‐se que tanto as formas induzíveis de HSPA1A e HSPA6 (HSP70B’) como a forma cognata HSPA8 de HSP70 se acumulariam no espaço extracelular de diferentes tipos de células após estímulos de estresse adequados. Entretanto, apenas o kit HSPA1A Elisa foi submetido a avaliação global e tem a sensibilidade (intervalo pg/mL) para detectar quantidades mínimas de HSP70 em meios de cultura e soros. Além disso, os resultados anteriores desse laboratório23 indicaram que as principais formas de eHSP70 (HSPA1A e HSPA8) são secretadas em quantidades semelhantes. Portanto, supôs‐se que a forma HSPA1A é representativa da secreção total de eHSP70. Os resultados do presente estudo indicam que o dano coclear induzido pela exposição ao ruído é acompanhado por HSR local e sistêmica. Assim, os níveis plasmáticos de eHSP72 podem ser usados como um biomarcador do estresse coclear causado por exposição ao ruído.

Devido à versatilidade da HSP70 em induzir diferentes respostas inflamatórias de acordo com sua localização, é provável que essa proteína possa ser um marcador importante para o estado imunoinflamatório durante o exercício.26 De fato, seus níveis na circulação parecem ser fundamentais para a manutenção da homeostase.19 Além disso, o balanço da razão [eHSP72/iHSP70], medido pelo cálculo matemático do índice H, pode representar um importante biomarcador de saúde e servir como referência para processos biológicos subclínicos.

Nossos dados demonstram que o tratamento com DIP prejudica a liberação de eHSP72 em ratos expostos ao ruído. Possivelmente, a glutamina diminui o estresse oxidativo e, portanto, reduz o estresse celular. Podemos descartar a hipótese de que diminuições na liberação de eHSP72 são devidas ao mau funcionamento celular (por exemplo, morte, necrose ou apoptose celular), já que o limiar auditivo foi similar nos grupos PAIR e DIP+PAIR. Além disso, a média do índice H no grupo PAIR foi de 16,0, enquanto no grupo DIP+NIHL foi de aproximadamente 1,0 (unidades arbitrárias da concentração de eHSP72/iHSP72). Esses achados são satisfatórios, porque o índice H pode estratificar o estado de HSP70 (ou seja, o índice H de um, em relação ao perfil normal, e os índices‐H mais altos sob um perfil de estresse), bem como outras condições clínicas de acordo com seus estados imunoinflamatórios.22 De fato, o índice‐H emergiu recentemente como um potencial biomarcador do efeito de situações de estresse no sistema imune e de desequilíbrios imunoinflamatórios relacionados a flutuações de níveis de citocinas e HSR deficitária. Finalmente, o alto valor do Índice H observado aqui (15,7 no grupo PAIR) aproxima‐se do ponto de inflexão (19,18, unidades arbitrárias da razão eHSP72/iHSP70), o que representa um perigoso perfil pró‐inflamatório.22

Nossos dados indicam que o dano coclear induzido pela exposição ao ruído é acompanhado por respostas de choque térmico local e sistêmico. Além disso, a suplementação com DIP não evitou a perda auditiva induzida por ruído, mas promoveu uma redução nos marcadores de estresse. Os resultados deste estudo confirmam que os níveis plasmáticos de proteínas de choque térmico de 72 kDa podem ser usados como biomarcadores de estresse auditivo após a exposição ao ruído.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (PqG‐2013‐Fapergs processo 002106‐2551/13‐5 e ARD/PPP/Fapergs/CNPq‐08/2014 processo 16/2551‐0000196‐6) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico9 (CNPq) (Universal MCTI/CNPq N° 01/2016). ABS foi bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes).

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.