Camundongos BALB/c fêmeas (6‐8 semanas de idade) foram adquiridos no Chinese Academy of Sciences Shanghai Laboratory Animal Center de Xangai. Camundongos com deficiência dupla Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ com uma base genética BALB/c (6‐8 semanas de idade) foram adquiridos da Cyagen US Inc. Santa Clara, CA, EUA. Os camundongos foram mantidos em cabines de fluxo laminar horizontal e receberam alimentos e água estéreis em uma instalação específica livre de patógenos. Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Fudan University (número ético: 201808001Z). Esses camundongos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos (n = 12 para cada grupo).

De acordo com os procedimentos publicados,8 esses camundongos receberam 0,5mg/mL de ovalbumina (OVA) (grau V; Sigma‐Aldrich, St. Louis, Missouri) e 20mg/mL de hidróxido de alumínio (Alúmen) (Sinopharm Chemical Reagent Co Ltd., Xangai, China) em solução salina normal na dose de 0,2mL por camundongo através de injeção intraperitoneal. A sensibilização foi repetida três vezes em intervalos semanais (dias 1, 8 e 15). Em seguida, os camundongos foram submetidos a teste de provocação através da instilação diária de gotículas de solução de OVA (40mg/mL em solução salina normal) nas narinas (0,02mL por camundongo) com uma micropipeta nos dias 22 a 29 (fig. 1). Como controle negativo, um grupo de camundongos recebeu o teste de provocação de tratamento com solução salina normal isoladamente (grupo normal). Dois grupos de camundongos alérgicos (grupo selvagem [Wild]: tratamento de camundongos alérgicos com nuócitos de camundongos do tipo selvagem; grupo Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐: tratamento de camundongos alérgicos com nuócitos de camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐)‐) receberam o transferência adotiva de nuócitos de camundongos do tipo selvagem ou camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ cultivados in vitro por via intravenosa na veia da cauda em dias de teste de provocação, respectivamente, enquanto outro grupo de camundongos alérgicos não foi tratado com nuócitos (grupo RA). Além disso, outro grupo de camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ recebeu a transferência adotiva de nuócitos de camundongos do tipo selvagem cultivados in vitro por via intravenosa na veia da cauda em dias de teste de provocação. Os sintomas nasais relevantes foram avaliados contando o número de espirros e fricções nasais durante 10 minutos imediatamente após o último teste de provocação intranasal com OVA no dia 29.

Figura 1.

Protocolos do estudo.

(0,14MB).

Foi administrado diariamente por 3 dias por via intraperitoneal 0,4μg por dose de rmIL‐25 de camundongo (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA) e rmIL‐33 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Os animais de controle receberam apenas PBS. Os camundongos foram sacrificados 24 horas depois e os dentes da frente foram removidos. A mandíbula inferior e os músculos da bochecha foram removidos e o NALT foi exposto removendo‐se cuidadosamente a placa. O NALT estava localizado na parte posterior da placa e foi retirado com agulhas de seringa em meio de cultura RPMI 1640 gelado, suplementado com 10% de FBS. Também foram obtidos tecidos de mLN. Todos esses tecidos foram picados com tesoura estéril em pedaços de aproximadamente <2mm e digeridos com 200μL de colagenase tipo III 200 U/mL (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 200μL de DNase Tipo IV 200μg/mL (Sigma – Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e depois passados através de um filtro de células Falcon® 70μm. Os glóbulos vermelhos foram lisados em solução de cloreto de amônio tamponado com Tris (NH4Cl a 0,83% e 20mM Tris/Cl).

As suspensões de células NALT e mLN de camundongos do tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ foram centrifugadas por 10min a 200 ×g a 4°C e as células foram colhidas para análise por citometria de fluxo. Essas células foram lavadas com 200μL de meio de citometria de fluxo [FCM, 1% de BSA e 0,1% de azida de sódio em PBS] e incubadas com 50μL de soro de coelho por 5min à temperatura ambiente para bloquear o receptor Fcγ. Essas células foram então lavadas três vezes com FCM e coradas com 50μL de anticorpos monoclonais contra as seguintes moléculas de superfície a 4°C por 30min a 1 × 108 células/mL: CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD19, FcɛR1, IL17BR; todos os anticorpos foram adquiridos de MyBioSource, Inc., San Diego, CA, EUA ou BioLegend, San Diego, CA, EUA e conjugados com isotiocianato de fluoresceína e anticorpo monoclonal ICOS (adquirido de MyBioSource, Inc., San Diego, CA e conjugado com ficoeritrina). Eles foram lavados novamente e incubados com 50μL de anticorpo secundário (IgG de coelho anticamundongo conjugado com biotina; Dako Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca), seguido de 50μL de estreptavidina conjugada com R‐ficoeritrina (RPE‐estreptavidina; Dako Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca). Após a coloração, as células foram ressuspensas em tampão de coloração com dicloridrato de 4’,6‐diamidino‐2‐fenilindole (DAPI) para exclusão de células mortas. Os controles para análise de cor única foram feitos incubando células com um anticorpo primário do mesmo isotipo, mas com especificidade irrelevante em concentrações correspondentes seguidas por reagentes secundários, como descrito acima. As amostras foram coletadas em um citômetro de fluxo LSR II equipado com o software FACSDIVA (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA) e analisadas com FlowJo versão 10 (Tree Star, Inc., Ashland, OR). A configuração do instrumento foi feita visualmente e a seleção do anticorpo de controle do isotipo estava de acordo com o anticorpo primário da espécie hospedeira, o isotipo e o formato de conjugação.

Nuócitos de NALT e mLN de camundongos de tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ foram todos classificados e purificados como células CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcɛR1 (linhagem)‐ICOS+ a uma concentração máxima de 6 × 107 células / mL. Eles foram cultivados por 6 dias em RPMI com 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,1% de β‐Mercaptoetanol, 10 ng/mL de rmIL‐7 de camundongo (BioLegend, San Diego, CA, EUA) e 10 ng/mL de rmIL‐33 de camundongo (BioLegend, San Diego, CA, EUA).

Então, as células do mLN dos camundongos do tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ foram incubadas com 100 ng/mL de rmIL‐25 (BioLegend, San Diego, CA, EUA) e 100 ng/mL de rmIL‐33 (BioLegend, San Diego, CA, EUA) nas culturas. As culturas foram mantidas por 3 dias. Os sobrenadantes celulares foram usdos para medir a produção de IL‐5 e IL‐13 com o ensaio de imunoabsorção enzimática (Elisa) e as células foram usadas para avaliar o conteúdo dos RNAs mensageiros (mRNA) de IL‐5 e IL‐13 por reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa (RT‐PCR). Depois disso, os nuócitos de camundongos do tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ ou nuócitos de camundongos do tipo selvagem foram ressuspensos em solução salina normal e transferidos adotivamente para camundongos RA ou Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ a 100μL por rato por via intravenosa na veia da cauda em dias de testes de provocação nasal.

Nuócitos de mLN de camundongos do tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ foram semeados em lamínulas de vidro e cultivados por 48 horas. As células aderentes foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% por 5min à temperatura ambiente; depois, lavadas três vezes com PBS com 0,2% de Triton X‐100 (PBS‐T) e bloqueadas com albumina sérica bovina a 3% (em PBS) por 30min. As amostras foram então incubadas durante a noite à temperatura ambiente com anticorpos primários contra IL‐13. Após a lavagem com PBS (3 x 5 minutos), as amostras foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente com anticorpos secundários conjugados com isotiocianato de fluoresceína no escuro. As lamínulas foram então lavadas duas vezes com PBS‐T antes da coloração do núcleo com 10mg/mL de DAPI por 5min à temperatura ambiente. Finalmente, as lamínulas foram lavadas três vezes com PBS‐T e duas vezes com PBS antes de serem montadas com Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). Como controles negativos, as amostras de células foram incubadas com o anticorpo secundário isolado ou com o anticorpo primário pré‐adsorvido com um peptídeo bloqueador específico (1: 5 p/ p). As imagens foram obtidas com um microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP5 com o Leica Confocal Software (LCS) 2.61 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). As imagens foram analisadas pelo software LCS Lite (Leica). Para permitir a comparação, todas as imagens foram adquiridas com os mesmos parâmetros de potência do laser e sensibilidade do fotomultiplicador. As imagens mostradas são representativas de pelo menos três experimentos separados em cada condição e foram processadas com valores idênticos de contraste e brilho.

Após a eutanásia dos camundongos, uma agulha de calibre 18 foi apontada em direção às cabeças de uma parte de camundongos para o LLN. Foi aplicada uma injeção de 2000μL de solução salina normal e o líquido foi coletado com um tubo sob ambas as narinas para o LLN. Uma parte do LLN foi centrifugada por 10 minutos a 150g a 4°C. Os sobrenadantes foram armazenados a ‐70°C para ensaios de IL‐5 e IL‐13. Outra parte do LLN foi coletada para detecção de eosinófilos e contagens diferenciais de células foram feitas em 150 células com uma citocentrífuga cytospin (Cytospin 4 Shandon Ltd., Runcorn, Reino Unido) coradas com Giemsa.9

A IL‐5 na cultura e o LLN foram medidos com uma microplaca de 96 poços revestida com 1μg/mL de anticorpo de coelho IL‐5. A microplaca foi incubada em albumina de soro bovino a 3% a 37°C por 1h. Amostras na diluição de 1:10 foram então adicionadas seguidas de incubação a 37° C por 1h. Após a lavagem, o anticorpo anti‐IL‐5 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA) foi biotinilado com um kit de biotinilação (American Qualex International Inc, San Clemente, CA, EUA); a amostra foi então adicionada a 1μg/mL e incubada a 25° C por 1h. Após a lavagem, foi adicionado 1,5μg/mL de estreptavidina peroxidase, seguido de incubação a 25°C por 1h. Após a lavagem, substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (12,5mL de tampão fosfato cítrico, 200μL de solução‐estoque TMB [6mg/mL em dimetilsulfóxido], 100μL de 1% de peróxido de hidrogênio; FlukaChemical Co, Ronkonkoma, NY, EUA) foi adicionado para produzir uma reação de cor. A reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico 6N. A densidade óptica foi determinada a 450nm com um leitor de microplacas (Microplate Reader MTP‐32; Corona Electric, Ibaraki, Japão). As concentrações de IL‐13 na cultura e IL‐13, IL‐25 e IL‐33 no LLN foram avaliadas com os kits Elisa correspondentes (adquiridos da R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA, ou MyBioSource, Inc. San Diego, CA, EUA).

Os mRNAs de IL‐5 e IL‐13 nas culturas de nuócitos foram analisados por RT‐PCR em tempo real. O RNA total de uma parte das amostras foi extraído com Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e tratado com DNase livre de RNase. Para a transcrição reversa, 2μg do RNA acima foram transcritos reversamente com hexâmeros aleatórios (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e o cDNA foi amplificado de acordo com as instruções do fabricante. Os primers foram projetados com o software Primer Express (ABI) a partir de sequência disponível no Genbank e foram sintetizados (Geneland Biotech, Xangai, China). A RT‐PCR em tempo real foi usada para detectar mRNAs de IL‐5 e IL‐13. Os primers da IL‐5 foram: primerforward, 5’‐TCACCGAGCTCTGTTGACAA‐3’ e reverse, 5’‐CCACACTTCTCTTTTTGGCG‐3’. Os primers da IL‐13 foram: forward, 5’‐AGACCAGACTCCCCTGTGCA‐3’ e reverse, 5’‐TGGGTCCTGTAGATGGCATTG‐3’. O mRNA de GAPDH também foi examinado para controlar a variação amostra a amostra no isolamento e na integridade do RNA com um par de primers: forward 5’‐ACCACAGTCCATGCCATCAC‐3’ e reverse 5’‐TCCACCACCCTGTTGCTGTA‐3’. Após a desnaturação inicial a 95°C por 10min, o perfil de amplificação foi de 15s de desnaturação a 95°C, 1min de pareamento ou annealing e extensão a 60°C por 45 ciclos. As misturas de reação de controle negativo de RT não continham transcriptase reversa e nenhum cDNA nas misturas de amplificação por PCR. Para a medida, 2μL de cDNA diluídos foram amplificados em um volume total de reação de 20μL com um sistema de 7500 PCR em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com 20×SYBR green mix (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A especificidade dos produtos de PCR foi avaliada por análise da curva de melting e pelo tamanho em géis de agarose. Com três diluições de cDNA, a linearidade da amplificação por PCR foi controlada. A avaliação dos dados foi feita pelo método ΔCT com GAPDH como padrão interno.

Uma análise estatística foi feita com um software estatístico disponível comercialmente GraphPad Prism, 6.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Os dados foram analisados com o teste t de Student não pareado±correção de Welch e apresentados como média±EPM (erro‐padrão da média). A significância de uma diferença foi aceita ao nível de confiança de 5%; p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Nuócitos do NALT de camundongos do tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ foram classificados e purificados como células de linhagem ‐ICOS+ (fig. 2 A e B).6 As comparações entre o número e a porcentagem de nuócitos do tipo selvagem indicaram que seu número e porcentagem total não estavam aumentados estatisticamente no NALT em resposta ao tratamento intraperitoneal com rmIL‐25 e rmIL‐33 (fig. 2C e D). Quanto aos camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, o número e a porcentagem de nuócitos também não apresentaram aumento significativo após a administração de rmIL‐25 e rmIL‐33 (fig. 2C e D). Além disso, não houve diferenças estatísticas entre os nuócitos de tipo selvagem e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ no número e porcentagem por NALT antes e após o tratamento com rmIL‐25 e rmIL‐33 (fig. 2C e D). A partir dos resultados, concluímos que a administração intraperitoneal de rmIL‐25 e rmIL‐33 não influencia a proliferação de nuócitos localizados no NALT.

Figura 2.

Nuócitos de NALT. A, Nuócitos de camundongos do tipo selvagem. B, Nuócitos de camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐. C, Número de nuócitos. D, Porcentagem de nuócitos. Cada valor representa a média (EPM) de 6 camundongos em cada grupo. Wild, camundongos do tipo selvagem; Wild (IL‐25+IL‐33), camundongos do tipo selvagem com o tratamento de rmIL‐25+rmIL‐33; Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐; Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ (IL‐25+IL‐33), camundongos (IL‐25+IL‐33), Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ com tratamento de rmIL‐25+rmIL‐33.

(0,35MB).

Nuócitos de mLN de camundongos do tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ também foram classificados e purificados como células da linhagem ‐ICOS+ (fig. 3 A e B).4 Comparações do número e porcentagem de nuócitos do tipo selvagem (Wild) demonstraram que o número total e a porcentagem estavam aumentados estatisticamente no mLN em resposta ao tratamento intraperitoneal com rmIL‐25 e rmIL‐33 (fig. 3C e D). Nos camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, o número e a porcentagem de nuócitos não indicaram aumento significativo após a aplicação de rmIL‐25 e rmIL‐33 (fig. 3C e D). Além disso, não houve diferenças estatísticas entre nuócitos de tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ no número e porcentagem por mLN antes do tratamento com citocinas e grandes diferenças após o tratamento com citocinas (fig. 3C e D). Os dados demonstram que os nuócitos não aumentam nos camundongos combinados Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ no mLN em resposta a rmIL‐25 e rmIL‐33,4 e IL‐25 e IL‐33 são necessários para a geração de nuócitos durante a inflamação do tipo 2.

Figura 3.

Nuócitos do linfonodo mesentérico (mLN). A, Nuócitos de camundongos do tipo selvagem. B, Nuócitos de camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐. C, Número de nuócitos por mLN. D, Porcentagem de nuócitos por mLN. Cada valor representa o erro‐padrão da média (EMP) de 6 camundongos em cada grupo. Wild, camundongos do tipo selvagem; Wild (IL‐25 + IL‐33), camundongos do tipo selvagem com o tratamento de rmIL‐25 + rmIL‐33; Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐; Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ (IL‐25+IL‐33), camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ com o tratamento de rmIL‐25 + rmIL‐33. **** p < 0,0001 vs. Wild (IL‐25 + IL‐33).

(0,67MB).

Para investigar se os nuócitos derivados de mLN produzem citocinas tipo 2 em camundongos do tipo selvagem (Wild) e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, determinamos a expressão de IL‐13 com imunocitoquímica e microscopia confocal e avaliamos o conteúdo de IL‐5 e IL‐13 em resposta a rmIL‐25 e rmIL‐33 na cultura com Elisa e RT‐PCR em tempo real. A IL‐13 foi expressa em nuócitos do tipo selvagem e Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, de acordo com a análise de imunofluorescência (fig. 4 A – F). Não houve diferenças estatísticas em proteínas e mRNAs de IL‐5 e IL‐13 entre esses dois tipos de nuócitos antes do tratamento com rmIL‐25 e rmIL‐33 (fig. 4 G‐J). As expressões de IL‐5 e IL‐13 estavam aumentadas significativamente após a administração dessas duas citocinas em nuócitos do tipo selvagem (Wild), seja em proteína ou mRNA; entretanto, houve diferenças significativas entre esses dois tipos de nuócitos nas expressões dessas citocinas do tipo 2 (fig. 4 G‐J). Entretanto, as concentrações de IL‐5 e IL‐13 não estavam up‐reguladas nos nuócitos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ após o tratamento acima (fig. 4 G, H, I e J). Os achados indicam que o knockout combinado Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ em camundongos priva os nuócitos de respostas à IL‐25 e IL‐33, o que contribui para a falta de up‐regulação de IL‐5 e IL‐13.4

Figura 4.

Expressão de IL‐13 em nuócitos e respostas de nuócitos derivados de linfonodos mesentéricos (mLN) à interleucina (IL)‐25 e IL‐33 recombinante de camundongo (rm) na cultura. A, IL‐13 em camundongos do tipo selvagem (Wild) [Dicloridrato de 4’,6‐diamidino‐2‐fenilindole (DAPI)]. B, IL‐13 em camundongos do tipo selvagem (Wild) (isotiocianato de fluoresceína). C, IL‐13 em camundongos do tipo selvagem (Wild) (mesclagem). D, IL‐13 em camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ (DAPI). E, IL‐13 em camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ (Isotiocianato de fluoresceína). F, IL‐13 em camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ (mesclagem). G, IL‐5 na cultura. H, IL‐13 na cultura. I, mRNA de IL‐5 em nuócitos. J, RNAm de IL‐13 em nuócitos. Barras de escala: 10μm. Ampliação original: × 400. Cada valor representa a média (EPM) de 6 camundongos em cada grupo. Wild, camundongos do tipo selvagem; Wild (IL‐25 + IL‐33), camundongos do tipo selvagem com o tratamento de rmIL‐25 + rmIL‐33; Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐; Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ (IL‐25+IL‐33), camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ com o tratamento de rmIL‐25 + rmIL‐33. ****p < 0,0001 vs. Wild (IL‐25 + IL‐33). ***p < 0,001 vs. Wild (IL‐25+IL‐33).

(0,2MB).

Para avaliar as reações alérgicas em modelos de camundongos do tipo selvagem estabelecidos por OVA, espirros e fricção nasal foram contados após o último teste de provocação. Os camundongos RA mostraram número estatisticamente maior de espirros e fricção nasal em comparação com os camundongos normais (fig. 5 A e B). O número de eosinófilos distribuídos no LLN e o conteúdo de IL‐5, IL‐13, IL‐25 e IL‐33 no LLN de camundongos RA também apresentaram aumento em comparação com os de camundongos normais (fig. 5C). Os resultados sugerem claramente que o modelo murino de RA foi estabelecido com sucesso. A transferência adotiva de nuócitos de mLN de camundongos do tipo selvagem (Wild) por via intravenosa na veia da cauda aumentou o número de espirros, fricção nasal e eosinófilos e as concentrações de IL‐5, IL‐13, IL‐25 e IL‐33 no LLN em comparação com camundongos RA (fig. 5 A‐G). Além disso, houve diferenças estatísticas entre os tratamentos com nuócitos do tipo selvagem e com os nuócitos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, seja em relação ao número de espirros, fricções nasais e eosinófilos, ou níveis de citocinas do tipo 2 no LLN (fig. 5 A‐G). No entanto, todos os parâmetros acima mostraram‐se inalterados estatisticamente após a transferência adotiva de nuócitos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ em camundongos RA (fig. 5 A‐G). Esses achados demonstram que os nuócitos pioram a resposta alérgica em camundongos com RA, possivelmente através das expressões up‐reguladas de IL‐5 e IL‐13 por IL‐25 e IL‐33 produzidas a partir do epitélio da mucosa nasal10 e pelo maior aumento da produção de IL‐25 e IL‐33 por células epiteliais após a estimulação de nuócitos.

Figura 5.

Pioria da inflamação alérgica em modelos de camundongos por nuócitos do tipo selvagem (Wild) do linfonodos mesentéricos (mLN). A, espirros. B, Fricção nasal. C, Eosinófilos no líquido de lavagem nasal (LLN). D, interleucina (IL)‐5 no LLN. E, IL‐13 no LLN. F, IL‐25 no LLN. G, IL‐33 no LLN. Cada valor representa a média (EPM) de 6 camundongos em cada grupo. Normal, grupo normal; RA, grupo RA; Wild, tratamento de camundongos alérgicos com nuócitos derivados de mLN de camundongos do tipo selvagem (Wild); Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, tratamento de camundongos alérgicos com nuócitos derivados de mLN de camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐.

**** p < 0,0001 vs. RA ou Wild. *** p < 0,001 vs. RA.

(0,24MB).

Para determinar se a OVA poderia estabelecer modelos de RA em camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐, fizemos os protocolos com o alérgeno e alúmen de acordo com os mesmos procedimentos.8 Surpreendentemente, não houve diferenças significativas no número de espirros, fricções nasais e eosinófilos, ou nos níveis de citocinas tipo 2 no LLN entre camundongos não estimulados (tratamento sem OVA) e camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ estimulados com OVA (tratamento com OVA) (fig. 6 A‐G). No entanto, após a transferência adotiva de nuócitos do tipo selvagem (Wild) para os camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ combinados, esse último tipo mostrou uma up‐regulação estatisticamente acima dos parâmetros (fig. 6 A‐G). Enquanto isso, modelos de camundongos com RA foram estabelecidos com sucesso e as respostas alérgicas foram restauradas. Os resultados sugerem que ILC2s e citocinas inatas do tipo 2 são indispensáveis para o estágio inicial da condição alérgica.

Figura 6.

Restauração da inflamação alérgica em modelos combinados de camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐. A, Espirros. B, Fricção nasal. C, Eosinófilos no líquido de lavagem nasal (LLN). D, Interleucina (IL) ‐5 no LLN. E, IL‐13 no LLN. F, IL‐25 no LLN. G, IL‐33 no LLN. Cada valor representa a média (EPM) de 6 camundongos em cada grupo. Não estimulado, tratamento sem ovalbumina (OVA); Estimulado com OVA, tratamento com OVA; Nuócitos, tratamento de camundongos Il17br‐/‐Il1rl1‐/‐ com nuócitos derivados de mLN de camundongos do tipo selvagem (Wild). **** p < 0,0001 vs. Estimulado com OVA.

(0,25MB).